1. Não Patenteável	imprimir

Segundo a Lei de Propriedade Intelectual do Brasil no. 9.279, artigo 10, o que não se considera patenteável:

Art. 10 - Não se considera invenção nem modelo de utilidade:
....
VIII - técnicas e métodos operatórios, bem como métodos terapêuticos ou de diagnóstico, para aplicação no corpo humano ou animal; e
IX - o todo ou parte de seres vivos naturais e materiais biológicos encontrados na natureza, ou ainda que dela isolados, inclusive o genoma ou germoplasma de qualquer ser vivo natural e os processos biológicos naturais.

2. Engenharia Genética e Biotecnologia : Biotecnologia – Conceitos Básicos	imprimir

Helen Kreuzer
Adrianne Massey
2a ed. - 2002
Artmed Editora

3. Biotecnologia – definição	imprimir

Biotecnologia vem das palavras “bio” e “tecnologia”, definição clássica de uso dos organismos vivos para solucionar problemas de tecnologia ou desenvolver produtos novos e úteis.
A “nova biotecnologia” pode ser definida como: utilização de células e moléculas biológicas para a solução de problemas ou produção de “produtos úteis”.

4.1 Tecnologia de anticorpos monoclonais	imprimir

A tecnologia dos anticorpos monoclonais (MCA) utiliza células do sistema imune para a produção de proteínas chamadas de anticorpos. Um tipo de célula do sistema imune, o linfócito B, responde à invasão pela produção de anticorpos que se ligam à substância estranha com grande especificidade.
Utilização de MCA em diagnóstico e terapêutica: os testes de gravidez comprados em farmácias utilizam um MCA que se liga a um hormônio produzido pela placenta. Os MCA estão sendo utilizados para diagnóstico de doenças infecciosas, como a inflamação da garganta causada por estreptococos, gonorréia, câncer, etc.

4.2 Tecnologia de bioprocessamento	imprimir

A tecnologia de bioprocessamento utiliza células vivas ou componentes de sua maquinaria bioquímica para fazer o que normalmente fazem: sintetizar produtos, degradar substâncias e produzir energia. As células vivas mais utilizadas são dos microrganismos unicelulares, como bactérias e leveduras, ou células de mamíferos. Os componentes celulares mais utilizados são proteínas chamadas de enzimas.
Esta tecnologia é muito empregada na produção de produtos químicos para gerar energia e degradar compostos poluentes.

• Fermentação e cultura de células de mamíferos
Comercialmente são fabricadas grandes variedades de produtos biotecnológicos através de fermentação em larga escala e da cultura de células de mamíferos, por exemplo.
Emprego da fermentação por microrganismos já é antigo, sendo o mais conhecido os micróbios utilizados no metabolismo da glicose (produtos secundários utilizados pelo homem: dióxido de carbono oriundo da fermentação de pães, etanol para fabricação de vinhos e cervejas, ácido lático para fazer iogurtes, ácido acético (vinagre) para a conservação de alimentos, etc).
Hoje ampliamos o emprego da fermentação microbiana para sintetizar antibióticos, aminoácidos, hormônios, vitaminas, solventes industriais, pesticidas, agentes processadores de alimentos, pigmentos, enzimas, inibidores enzimáticos e fármacos.



• Biodegradação
O emprego de microrganismos e enzimas utilizados para a degradação de moléculas orgânicas podem, por exemplo, resolver problemas ambientais como: derramamento de óleo, locais com lixos tóxicos, etc.
A utilização de populações de microrganismos para combater a poluição é conhecida como biorremediação.
O emprego de plantas no controle de contaminações causadas por poluição (águas residuais industriais ou na absorção de metais tóxicos, solventes orgânicos ou elementos radioativos) é chamado de fitorremediação.

4.3 Tecnologia da cultura de células	imprimir

A tecnologia da cultura de células consiste no crescimento de células com nutrientes apropriados em erlenmeyers ou em grandes bioreatores.

• Cultura de células vegetais
A cultura de células vegetais é um aspecto essencial na biotecnologia vegetal graças à propriedade única das células vegetais de totipotência, isto é, sua capacidade de gerar planta multicelular completa a partir de uma única célula diferenciada.
Assim uma única célula geneticamente modificada (por exemplo, para aumentar sua resistência a pestes causadas por insetos) pode ser cultivada e originar uma planta com características melhoradas.

• Cultura de célula animal
A utilização de culturas de células de insetos como meio de crescimento de vírus que infectam insetos nos permite ampliar a aplicação dos vírus como agentes de controle biológico. Culturas de células de mamíferos também são utilizadas como estoque vivo para cruzamento.
A comunidade médica utiliza a cultura de célula animal para estudar certas questões como eficiência e segurança de certos compostos farmacêuticos, mecanismo molecular da infecção e replicação viral, toxicidade de compostos e bioquímica básica da célula.

• Cultura de células-tronco embrionárias
As células-tronco embrionárias podem originar, virtualmente, qualquer tipo de célula.

4.4 Tecnologia de engenharia de tecidos	imprimir

Através da tecnologia de engenharia de alimentos pode-se formar tecidos, partindo-se de material biodegradável (colágeno ou polímeros) e células vivas. Inicialmente desenvolveu-se pele e cartilagem artificiais, sendo que no futuro dever-se-á desenvolver diversos tipos de tecidos, objetivando órgãos mais complexos.

4.5 Tecnologia de engenharia genética	imprimir

A tecnologia da engenharia genética é normalmente chamada de tecnologia do DNA recombinante (rDNA). O DNA recombinante é feito pela ligação ou recombinação de material genético de duas origens diferentes. Na natureza, o material genético é constantemente recombinado quando há o crossing over entre cromossomos homólogos do pai e da mãe durante a formação dos gametas, quando o óvulo e o espermatozóide se fundem durante a fertilização, etc.

• Bacillus thuringiensis (Bt)
Existe vários estudos desenvolvidos empregando o gene da bactéria Bacillus thuringiensis, chamada de Bt para simplificar. O Bt é um organismo natural que produz uma proteína que mata certos insetos, mas não oferece perigo para outros organismos como peixes, pássaros ou mamíferos.
Cada linhagem de Bt é tóxica somente a certos grupos de insetos. Assim, certas linhagens de Bt são tóxicas a borboletas e mariposas, enquanto outras são tóxicas a besouros e outras a mosquitos. Cada uma destas linhagens produz uma versão ligeiramente diferente da proteína tóxica. O Bt tem sido utilizado por muito tempo como agente de controle biológico.
O gene Bt (que produz a endotoxina) foi transferido, por exemplo, para bactérias que vivem naturalmente dentro do talo do milho, para ajudar na proteção contra a broca do milho. Em outro caso, as bactérias que vivem nas raízes da planta do milho receberam o gene Bt, que protegeram as plantas contra as pragas da raiz do milho.

4.6 Tecnologia da engenharia de proteínas	imprimir

Visa melhoria das proteínas já existentes ou mesmo de anticorpos (as abenzimas).

• Engenharia das abenzimas
As abenzimas são anticorpos com habilidades catalíticas (os anticorpos se ligam por se ligar; e as enzimas se ligam para promover reações químicas).

4.7 Tecnologia do anti-senso	imprimir

A tecnologia do anti-senso é utilizada para bloquear ou diminuir a produção de certas proteínas. Isto é feito utilizando pequenos ácidos nucléicos (oligonucleotídeos) que evitam a tradução da informação contida no DNA, em proteína.
Esta tecnologia é muito empregada no controle de doenças virais, inflamatórias, asma, câncer e talassemia.

5.1 Agentes terapêuticos endógenos	imprimir

O corpo humano produz a maioria de nossos próprios compostos terapêuticos, muitos dos quais são proteínas. A biotecnologia permite que estes agentes sejam produzidos em maior escala, facilitando o tratamento de necessitados.
Como exemplo deste tipo de substância, podemos citar a interleucina-2, que ativa a resposta por célula T; a eritropoietina, que regula a produção de células vermelhas (eritrócitos); o ativador de plasminogênio do tecido, que dissolve coágulos sanguíneos, etc.

5.2 Biopolímeros	imprimir

Os materiais biológicos podem ser mais compatíveis com nossos tecidos e são degradados e absorvidos quando sua função foi realizada. A produção de polímeros biológicos, além das qualidades acima citadas, também são melhores para o meio ambiente.
Como exemplo de biopolímeros podemos citar: o carboidrato hialuronato, solúvel em água, viscoso, elástico, semelhante ao plástico, que é empregado no tratamento de artrite, na prevenção de cicatrizes pós-cirúrgicas, em cirurgia de catarata e na embalagem de fármacos; a quitina, um carboidrato encontrado no exoesqueleto de insetos e crustáceos, combinado com fibra natural, cria um material que limita o crescimento de bactérias e fungos.

5.3 Terapias de substituição	imprimir

Muitas doenças resultam de genes defeituosos que levam a uma falta total ou produção inadequada de substâncias que o corpo normalmente produz.
A engenharia genética e as tecnologias de bioprocessamento podem produzir quantidades suficientes para servir como fonte garantida para as terapias de substituição. Por exemplo, o fator VIII é uma proteína envolvida no processo de coagulação do sangue (alguns hemofílicos perdem esta proteína); a insulina é uma proteína hormonal que regula os níveis de glicose no sangue por afetar a captação celular de glicose (a diabetes é resultante de uma produção inadequada de insulina).

5.4 Terapias contra o câncer	imprimir

Quando os genes envolvidos em certos eventos críticos do crescimento e desenvolvimento celular sofrem mutação, eles se tornam oncogenes, ou genes produtores de tumores. Os anticorpos monoclonais estão sendo usados para se ligar e inativar proteínas produzidas por estes genes.
Os seres humanos têm genes chamados supressores de tumores. Quando estes genes funcionam corretamente, suprimem o crescimento celular. Quando ambas as cópias destes genes tornam-se inativas ou ausentes, estes genes então atuam como oncogenes. Com a introdução de cópias normais destes genes em células tumorais através de terapia gênica, estes tumores podem regredir.

5.5 Vacina	imprimir

Geralmente, somente uma ou poucas proteínas da superfície do patógeno desencadeiam a produção de anticorpos. Pelo isolamento do gene para a(s) proteína(s) de superfície celular do patógeno e inserção em uma levedura ou uma bactéria como Escherichia coli, pode-se produzir grandes quantidades desta proteína para servir como vacina. Quando a proteína é injetada, o corpo produz anticorpos que podem reconhecer o patógeno e não causam nenhum dos efeitos adversos que às vezes podem ocorrer com a vacinação.

5.6 Vacinas de DNA	imprimir

Inserem-se genes para uma ou mais proteínas do patógenos em pequenos pedaços de DNA circular, não infeccioso, chamado plasmídeo. Após a introdução no hospedeiro, células do hospedeiro irão sintetizar a(s) proteína(s) do patógeno. Reconhecendo a proteína estranha, o sistema imune produz anticorpos e células T específicas para este antígeno.

6.1 A natureza descontínua dos genes	imprimir

Em 1865 um monge chamado Gregor Mendel apresentou uma palestra para a sociedade científica local em Brno, Tchecoslováquia. Ele descreveu, em grandes detalhes, os resultados de 8 anos de coleta de dados sobre o cruzamento de milhares de ervilhas. Ninguém se impressionou na época, mas o fato é que Mendel mudou a maneira como vemos o mundo natural. Apesar de nunca ter empregado o termo “gene”, ele revelou a natureza hereditária dos genes e fez nascer um novo ramo da biologia: a genética.
Quando o óvulo e o espermatozóide se fundem na fecundação, as partículas hereditárias materna e paterna não ficam unidas, mas mantêm suas diferentes identidades.
Como os genes são partículas independentes, os genes maternos e paternos para uma dada característica (alelos) separaram-se durante a produção de gametas.
Em 1869, um químico alemão Frederick Miescher isolou uma nova substância dos núcleos de leucócitos, à qual ele deu o nome de “nucleína”, que diferentemente das proteínas, tinha uma alta concentração de fósforo.
Mais tarde as análises químicas revelaram que os cromossomos eram feitos tanto de proteína quanto da nucleína de Miescher, que hoje chamamos de ácido desoxirribonucléico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid).

6.2 O fator transformante	imprimir

Em 1982, Frederick Griffith, que estudava vacinas, descobriu que deveria haver uma substância que chamou de “fator transformante” que poderia transmitir para uma espécie característica típica de outra espécie. Hoje, sabe-se que o fator transformante era o DNA.
Em 1943, O. T. Avery e seus colegas no Instituto Rockefeller purificaram o fator transformante e anunciaram que se tratava do DNA. Muitos cientistas duvidaram dessa notícia e persistiram na crença de que o material hereditário era feito de proteína. Eles duvidaram que o DNA, com apenas 4 subunidades, pudesse carregar informação suficiente para transformar um óvulo fertilizado em um ser humano. As proteínas, com 20 subunidades poderiam carregar muito mais informações.
Por volta de 1950, os cientistas Alfred Hershey e Martha Chase, através de experimentos com bacteriófagos, que são vírus que infectam bactérias, deram a resposta final para o debate: DNA versus proteína. Os vírus apresentam capa (capsídeo) protéica com uma pequena quantidade interna de material genético, geralmente DNA. Eles infectam a bactéria injetando seu material genético dentro dela, deixando a capa protéica do lado externo. Através de vírus marcados com isótopos radioativos de enxofre e fósforo, 35S e 32P, puderam demonstrar que o DNA possui fósforo, mas não enxofre; e as proteínas possuem enxofre, e não fósforo.
Em 1930, já se sabia que cada subunidade do DNA (nucleotídeo) consiste em um fosfato, uma desoxirribose e uma base nitrogenada.
O químico Erwin Chargaff foi quem descobriu que as moléculas de DNA sempre têm quantidades iguais de adenina e timina e quantidades iguais de citosina e guanina.
Em 1953, Frances Crick e James Watson descobriram a estrutura tridimensional do DNA, construindo um modelo: uma dupla hélice composta de duas fitas correndo em direções opostas com pareamento interno entre as bases, adenina, timina, citosina e guanina.
Em 1957, Frances Crick propôs o processo da tradução da informação: a informação fluido DNA através do RNA para as proteínas.

7. Evolução e mutações	imprimir

Evolução é simplesmente a mudança nas freqüências de alguns genes em um conjunto de genes de uma espécie.
Os agentes que causam o aparecimento da variação genética são a mutação e a recombinação.
Chamamos de mutação as mudanças na informação genética que uma célula carrega.

7.1 Tipos de mutações	imprimir

Duas classes são normalmente conhecidas:

• Macromutações, macrolesões ou aberrações cromossômicas:
  Quando ocorrem mudanças em longos segmentos de moléculas de DNA. Exemplos:
  - Por perda (deleção) ou adição (duplicação) de um ou mais genes, ou mesmo de um cromossomo inteiro;
  - Por mudanças nas posições dos genes uns em relação aos outros, sem nenhuma mudança na quantidade total de informação genética (inversões e translocações).
  
  
• Micromutações, microlesões ou mutações pontuais:
  Quando ocorrem mudanças na seqüência de nucleotídeos de um único gene (uma pequena quantidade de DNA é alterada).
  

7.2 Efeitos das mutações	imprimir

• Deleções e duplicações:
  Quando a quantidade total de informação genética muda, o resultado evolutivo pode ser profundo, como na especificação imediata que muitas vezes acompanha a duplicação do número de cromossomos, ou pode ser totalmente insignificante. Por exemplo, quando um cromossomo é perdido ou adquirido, o indivíduo é geralmente estéril, como no caso de humanos XO e XXY. Enquanto esta condição é devastadora para o indivíduo, ela não pode ser incorporada ao grupo gênico.
  Outro tipo de macromutação, a duplicação gênica, pode resultar num aumento na produção de proteína que contribui para a sobrevivência de um indivíduo, que será favorecida pela seleção natural.
  
  
• Inversões e translocações:
  Macromutações que envolvem mudanças nas posições de loci gênicos uns em relação aos outros também variam no efeito que tem no processo evolutivo.
  Quando uma sessão de cromossomo quebra, gira 180° e depois é re-inserida no mesmo cromossomo (inversão) ou quando cromossomos não-homólogos quebram e trocam pedaços de cromossomos (translocação) o resultado é geralmente, na melhor das hipóteses, esterilidade parcial.
  
  
  

7.3 Elementos transponíveis	imprimir

Uma forma especial de mutação que ocorre tanto em procariotos como em eucariotos envolve elementos transponíveis, ou “genes saltitantes”. Esses elementos transponíveis, que são também chamados transposons, são segmentos curtos do DNA que incluem um gene para uma proteína chamada transporase. Essa proteína faz com que o pedaço curto de DNA “salte” do seu local original para uma nova localidade, muitas vezes ao acaso, em alguma outra parte do material genético da célula. Às vezes, o salto envolve a formação de uma nova cópia dos transposons, às vezes não.
A inserção de um transposon em um novo local pode trazer um problema. O transposon pode cair no meio de um gene importante, alterar a seqüência de nucleotídeos dentro desse gene e impedir a síntese de proteína.

A. Transposons que se movem por transposição replicativa são duplicados no processo de salto, um mecanismo de copiar-e-colar. B. Transposons não-replicativos movem-se por um mecanismo recorta e cola. Nenhuma cópia é feita. Transposons replicativos e não-replicativos Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

7.4 Recombinação	imprimir

A recombinação é um outro mecanismo para gerar variação genética. É a associação de informação genética de duas fontes para produzir novas combinações genéticas. A recombinação é diferente da mutação, pois genes específicos não são alterados, mas simplesmente re-arranjados. Como exatamente os materiais genéticos de duas fontes se combinam varia de acordo com o modo de reprodução do organismo.

Reprodução sexuada e recombinação:
Envolve dois processos: a produção de gametas que diferem geneticamente do indivíduo que os produziu e a fusão desses gametas para criar um indivíduo que difere geneticamente de ambos os pais. A recombinação ocorre durante ambos os processos.
Como exemplo podemos citar a fecundação.
A recombinação também ocorre durante a produção desses gametas por meio da meiose. O aumento de variação genética em populações é o resultado de dois eventos meióticos associados: o arranjo e segregação independente de cromossomos não-homólogos e o crossing over que ocorre entre cromossomos homólogos.
O número de combinações possíveis de cromossomos não-homólogos que poderiam ser gerados na produção de cada gameta humano é de 2²³, ou mais de 8.000.000.
Ainda, outro evento de recombinação ocorre na meiose. Durante o pareamento de cromossomos homólogos, o material genético do cromossomo paterno é trocado com o material genético do cromossomo materno por meio do processo de crossing over. O cromossomo resultante é um recombinante: um híbrido contendo genes de ambas as origens, materna e paterna, ou uma nova combinação de material genético de duas fontes.

Reprodução sexuada, variação genética e recombinação. A variação genética é gerada em três estágios da reprodução sexuada. Quando os gametas são produzidos, eles diferem geneticamente do genótipo parental porque eles possuem a metade da quantidade de DNA e um arranjo ao acaso dos cromossomos materno e paterno. Durante a fertilização, os materiais genéticos de duas fontes são combinados, gerando um descendente que difere geneticamente de ambos os pais. Finalmente, durante a produção de gametas, ocorre o crossing over entre os cromossomos materno e paterno (homólogos), gerando variação genética “dentro do cromossomo”. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Reprodução assexuada e recombinação:
Muitos organismos não se reproduzem sexuadamente. Na reprodução assexuada (ou de um único pai), uma cópia do genoma do pai é passada, na sua totalidade, para os descendentes.

Reprodução assexuada. Os descendentes são geneticamente idênticos aos pais. A variação genética é gerada por mutação. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

A prole é, portanto, geneticamente idêntica ao organismo parental e é geralmente chamada de clone do pai. O grupo de organismos que resulta de uma reprodução repetida é chamado de população de clones, pois todos os membros da população são geneticamente idênticos entre si.
Como exemplos, podemos citar a reprodução de bactérias, as leveduras, alguns outros fungos, protozoários e algas, muitas plantas.
Entretanto, as bactérias possuem três tipos de mecanismos naturais por meio dos quais os materiais genéticos de duas fontes podem ser combinados:

- Conjugação: é um processo pelo qual uma bactéria transmite uma cópia de um pouco de seu DNA diretamente para outra bactéria;
- Transformação: uma nova combinação de material genético é criada quando as células absorvem DNA do meio externo. Um tipo de bactéria susceptível a transformação é a Escherichia coli;
- Transdução: um vírus intermediário carrega DNA de uma célula bacteriana para uma segunda célula.

Conjugação bacteriana. O material genético é trocado entre células F+ e F-

Transformação. Uma célula absorve DNA livre do meio externo, integrado em seu cromossomo e expressa os produtos codificados.

Transdução. Um vírus serve de transmissor do material genético de um organismo para outro. Neste exemplo, o organismo é uma bactéria, e o vírus um bacteriófago. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

8.1 O DNA	imprimir

O DNA é o material genético de toda a vida na Terra e é formado por apenas 6 componentes. Estes componentes são:

- uma molécula de açúcar (desoxirribose);
- um grupamento fosfato;
- quatro bases nitrogenadas diferentes: adenina, guanina, citosina, timina.

A unidade essencial que forma a molécula de DNA é chamada de nucleotídeo ou desoxinucleotídeo.

Um desoxinucleotídeo é formado por uma molécula de desoxirribose com um fosfato ligado em uma posição e uma das quatro bases nitrogenadas ligada à outra posição como mostra a figura a seguir.

O nucleotídeo. Os átomos de carbono da porção açúcar desoxirribose são numerados de acordo com a convenção química. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Na molécula de DNA, milhares ou milhões destes nucleotídeos estão agrupados em uma cadeia.
As ligações entre dois nucleotídeos são chamadas ligações fosfodiéster, que representa a ligação entre um açúcar e um fosfato como indicado abaixo:

Um trinucleotídeo. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

O esqueleto açúcar-fosfato do DNA é um elemento estrutural importante, embora toda a informação esteja contida nas quatro bases nitrogenadas.
A chave para a transmissão da informação genética reside no fato das bases formarem ligações através de pontes de hidrogênio aos pares, sendo que a estabilidade ocorre entre as bases: timina (T) e adenina (A), citosina (C) e guanina (G), que também são chamadas de bases complementares, indicadas abaixo:

Pares de bases complementares no DNA. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Na molécula de DNA, os dois esqueletos açúcar fosfato permanecem lado a lado (uma fita disposta da extremidade 5’ para a extremidade 3’ e a outra disposta da extremidade 3’ para 5’). As bases ligadas a uma fita estão pareadas com suas bases complementares, ligadas a fita oposta.
As duas fitas encontram-se “enroladas” ao redor da outra em uma conformação chamada dupla hélice.

8.2 Replicação do DNA	imprimir

Durante a replicação as duas fitas de DNA são “desenroladas” e com a ajuda de enzimas (DNA polimerase) tira-se um “molde” de cada, apresentando bases complementares, que ao se combinarem, dão origem a uma nova molécula de DNA.

9. Proteínas	imprimir

As proteínas fornecem a estrutura e desempenham as funções vitais dos seres vivos. A informação contida no DNA “converte-se” na produção destas proteínas, que diferem de ser vivo para ser vivo.
As proteínas são pequenas moléculas apresentando seqüências de aminoácidos, os quais compostos pelos elementos: carbono (C), hidrogênio (H), oxigênio (O) e nitrogênio (N). As proteínas são formadas a partir de um conjunto de 20 aminoácidos. São elas: glicina, alanina, leucina, valina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparaginina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, lisina e histidina.
As proteínas são compostas por uma seqüência de aminoácidos linear, com estrutura tridimensional única, apresentando “reentrâncias” ou “saliências” em sua forma espacial, que propiciam ligações altamente específicas como, por exemplo, hormônios, transmitindo assim, um sinal de crescimento da célula.

A alfa-hélice. O C alfa indica o átomo de carbono com a cadeia lateral, que não é mostrada. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Por meio destas interações, o receptor protéico pode propagar à célula o sinal hormonal.
A seqüência particular de aminoácidos de uma proteína vai provocar uma dobra da cadeia até adquirir uma “conformação” energeticamente mais estável e uma especificidade particular e suas conseqüentes propriedades e funções.
Um dos arranjos da proteína é a formação de um espiral helicoidal do esqueleto peptídico. Deste modo, os grupos NH e CO ao longo do esqueleto formam pontes de hidrogênio com grupos complementares situados acima ou abaixo deles. Este arranjo é chamado de alfa-hélice. A figura a lado ilustra este arranjo.
O DNA determina as características de um organismo porque ele determina a seqüência de aminoácidos de todas as proteínas deste organismo.
O DNA contém um código genético para os aminoácidos, no qual cada aminoácido é representado por uma seqüência de três bases do DNA. Estas trincas de bases são chamadas códons. A seqüência dos códons, em uma seqüência de DNA, é refletida na seqüência dos aminoácidos reunidos em uma cadeia protéica.

Gene é o trecho completo do DNA, necessário para determinar a seqüência de uma proteína. O conjunto completo dos genes de um organismo é chamado de genoma.

A seqüência de bases do DNA determina a seqüência de aminoácidos das proteínas Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

9.1 Síntese de proteínas	imprimir

O processo de síntese de proteínas ocorre em diversas etapas. A primeira etapa consiste em retransmitir a informação do DNA para os ribossomos. Enzimas celulares sintetizam uma cópia funcional de um gene para levar seu código genético até os ribossomos. Esta cópia funcional é chamada de RNA mensageiro (mRNA). O RNA é uma molécula extremamente parecida com o DNA. O mRNA transporta o código genético de uma proteína até os ribossomos.
Em uma segunda etapa da síntese de proteínas, os códons do mRNA devem ser associados aos aminoácidos corretos. Esta etapa é cumprida por um segundo tipo de RNA, chamado RNA transportador (tRNA). Finalmente os aminoácidos devem ser ligados para formar uma cadeia protéica. O ribossomo (que é formado de proteínas e RNA) executa esta função. Ao final um “sinal de terminação” genético informa ao ribossomo para liberar a nova proteína na célula.

10. O RNA	imprimir

O RNA é formado por nucleotídeos compostos de açúcar, fosfato e uma das quatro diferentes bases orgânicas. Entretanto existem 3 diferenças entre o DNA e RNA:

• No lugar do açúcar desoxirribose, o RNA contém o açúcar ribose (daí o nome ácido ribonucléico);
  
• O RNA é formado geralmente por apenas uma fita de esqueleto açúcar-fosfato e bases (não possui estrutura dupla-hélice como as bases pareadas), embora seja capaz de parear com outras fitas simples de DNA ou RNA.
  
• No lugar da base timina, o RNA contém a base uracila.
  

Diferenças químicas entre DNA e RNA. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

10.1 Síntese de mRNA	imprimir

O processo assemelha-se em muitos aspectos a replicações do DNA. A dupla hélice do DNA é desenrolada para revelar as bases que contêm as informações. Os nucleotídeos complementares que contêm ribose são pareados com as bases expostas. A base uracila substitui a timina e pareia com a adenina. Ligações fosfodiéster são formadas entre os nucleotídeos e o mRNA sintetizado é exatamente complementar à fita-molde de DNA. A este processo damos o nome de transcrição.
As moléculas de tRNA e RNA ribossomal também são codificadas no DNA e sintetizadas por transcrição, mas diferentemente ao mRNA elas não são transcritas em proteínas.
A enzima que sintetiza o RNA (RNA polimerase) deve selecionar corretamente a seqüência de nucleotídeos complementares e ligá-los (como faz o DNA polimerase), pois deve decidir onde um gene está localizado. Em outras palavras, deve determinar exatamente onde iniciar e terminar a síntese de RNA de modo a transcrever um gene completo.
Um promotor que é uma seqüência especial de bases de DNA indica onde iniciar a síntese do mRNA. Analogamente, uma seqüência especial de bases de DNA indica onde terminar a síntese. Esta seqüência final é chamada de terminador.

10.2 A síntese de uma proteína	imprimir

Após a conclusão da transcrição, o mRNA desloca-se até o ribossomo, onde ocorre a síntese de proteínas.
O ribossomo reconhece o mRNA e o prende na posição adequada para que seus códons sejam lidos corretamente.

Cada seqüência de 3 bases do DNA determinará um aminoácido específico que, ligados entre si, formarão a proteína desejada.
A tabela ao lado indica as possibilidades de seqüências (1ª base, 2ª base e 3ª base do DNA) e o conseqüente aminoácido codificado.

Para que uma proteína seja sintetizada é necessária a ação de um tRNA (RNA transportador). O tRNA tem uma conformação estrutural particular, conforme indicado na figura abaixo:

Uma molécula de tRNA. O pareamento de bases complementares entre diferentes regiões da molécula de tRNA mantém a sua estrutura. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Esta estrutura apresenta em um lobo, uma seqüência de 3 bases específicas chamada de anticódon e em outra extremidade um aminoácido específico, correspondente ao indicado pela seqüência de 3 bases ou códons do mRNA.
Assim, no ribossomo a seqüência de três bases ou códon vai atrair um anticódon complementar em cuja extremidade encontra-se um aminoácido, o qual através da ação de enzimas (aminoacil sintetases) vão se ligando seqüencialmente e ao final constituirão a proteína sintetizada conforme mostra a figura abaixo:

Tradução. O pareamento de bases complementares entre os anticódons das moléculas de tRNA selecionados e os códons do mRNA guia a formação da cadeia de aminoácido. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Este processo é chamado de tradução do mRNA em proteína específica.
O ribossomo distingue o mRNA do RNA, através de “sinais de comando”. Na bactéria, por exemplo, este elemento geralmente apresenta a seqüência 5’-GACG-3’ ou 5’-AGGA-3’ localizada de 8 a 13 nucleotídeos antes do códon de iniciação.
O elemento de reconhecimento do ribossomo é seguido por um códon de iniciação (geralmente AUG, que codifica metionina), onde a síntese de proteínas começa de fato.
A figura a seguir indica que como o mRNA apresenta códons de iniciação e de terminação, o próprio DNA na seqüência do gene também apresenta o códon complementar para a devida transcrição.

Principais “sinais de comando” em bactérias. Estes sinais informam à RNA polimerase onde iniciar e terminar a transcrição, possibilitam ao ribossomo reconhecer o mRNA e dirigem o ribossomo para começar e parar a síntese de proteínas. (RRE: elemento de reconhecimento do ribossomo) Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Importante: os códons de terminação são códons caracterizados por não existir seqüência de anticódon capaz de parecer com eles. Em vez disso, proteínas chamadas fatores de terminação ligam-se aos códons de terminação, fazendo com que a síntese da proteína termine.
Existem diferentes tipos de níveis de informação que determinam categorias de células quanto à síntese de proteínas. Estas categorias de células são as células eucarióticas e as células procarióticas.

11. Células eucarióticas e procarióticas	imprimir

As células geralmente encontradas na maioria dos seres vivos são as células eucarióticas. Apresentam em seu citoplasma organelas delimitadas por membrana como: mitocôndrias, cloroplastos, lisossomos e retículo endoplasmático, e um núcleo envolto em uma membrana nuclear.
As células procarióticas apresentam estrutura mais simples. Elas não apresentam organelas delimitadas por membranas e um núcleo organizado. Nestas células o material genético está localizado no citoplasma. Os dois principais grupos são: eubactérias e arquibactérias. Neste texto, quando nos referimos aos procariotos, estaremos tratando de eubactérias, que são organismos unicelulares.
O código genético usado em procariotos e em eucariotos é o mesmo. Apesar disto, a RNA polimerase eucariótica sozinha não é suficiente para começar a transcrição a partir de um promotor, enquanto a RNA procariótica é capaz.
Outra diferença entre genes eucarióticos e procarióticos é que os genes procarióticos existem em uma seqüência contínua em uma molécula do DNA e, com freqüência, vários são transcritos a partir do mesmo promotor. Em contraste, genes eucarióticos são comumente transcritos um de cada vez e estão em geral codificados em diversos pequenos pedaços separados por trechos de DNA não-codificante, chamados de íntrons.
Quando células eucarióticas transcrevem um destes genes “trincados”, um precursor longo de RNA (incluindo íntrons e as regiões codificantes, éxons) é sintetizado primeiro. Através do “processamento” ou splicing deste precursor, os íntrons são seletivamente removidos, e os éxons são unidos para formar o mRNA funcional. A figura abaixo ilustra este processamento:

Processamento (splicing) do RNA precursor para formar mRNA. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

Devido à rapidez e processo mais simples de produção de proteína, os biotecnologistas ficam atraídos pela transferência de material genético de eucariotos em procariotos, acompanhadas de sinais para o processamento correto e “pré-processar” o gene, se ele tiver íntrons.

11.1 Regulação da transcrição por meio de repressão	imprimir

Além dos promotores muitos genes possuem locais onde proteínas reguladoras podem se ligar, geralmente muito próximo do promotor. Estas proteínas impedem a transcrição do gene ou bloqueiam acesso ao promotor ou ação da RNA polimerase. Por este motivo são chamadas de repressoras (isto em células procarióticas).

11.2 Regulação da transcrição por meio de ativação	imprimir

Nas células eucarióticas, aparentemente muitos dos promotores não são eficientemente reconhecidos pela RNA polimerase sozinha. A RNA polimerase eucariótica necessita de proteínas assistentes, chamadas de ativadores de transcrição ou fatores de transcrição, para auxiliá-la a se ligar a um promotor e iniciar a transcrição. Alguns desses ativadores associam-se à enzima RNA polimerase e não se ligam diretamente ao DNA. Outros ativadores ligam-se a seqüências de bases específicas no DNA e então interagem com a RNA polimerase para ajudá-la na ligação a um promotor.
As regiões de ligação destes ativadores no DNA são geralmente chamados enhancers (intensificadores).

12.1 Cromossomos	imprimir

O empacotamento do DNA dentro da célula apresenta um problema devido ao enorme comprimento da molécula do DNA em relação ao tamanho da célula. Nas células, o DNA é dobrado e compactado em associação com proteínas. O conjunto DNA-proteína é chamado cromatina, e a estrutura compactada é chamada de cromossomo.

12.2 Plasmídeos	imprimir

Algumas células, em particular as bactérias, contêm pequenos anéis de DNA fora de seus cromossomos. Estes pequenos pedaços de DNA circular são chamados plasmídeos. Os plasmídeos são replicados pelas enzimas celulares e herdados pela progênie da bactéria. Eles geralmente contêm alguns milhares de pares de bases e codificam algumas proteínas. Nenhumas dessas proteínas são, normalmente, essencial para a sobrevivência da bactéria.

12.3 Genomas virais	imprimir

Vírus não são células. Eles são constituídos simplesmente de material genético fechado em uma cápsula, em geral feita de proteína. O material genético viral pode ser tanto DNA como RNA. Os vírus necessitam de uma célula hospedeira para produzir cópias deles mesmos.
Fora da célula hospedeira, os vírus estão bioquimicamente em estado de dormência e não são nem mesmo considerados vivos.
Os vírus que infectam bactérias são chamados de bacteriófagos, e desempenham um importante papel na biologia molecular (transferência gênica para célula hospedeira).

12.4 DNA não-codificante	imprimir

O menor vírus pode ter apenas alguns milhares de pares de bases. Como uma proteína “média” requer 1.200 bases de seqüência codificante, este vírus codifica apenas algumas proteínas. Uma bactéria como a E. coli contém aproximadamente 4 milhões de pares de bases em seu genoma, ao passo que o genoma humano é composto de aproximadamente 3 bilhões de pares de bases. No entanto, a salamandra americana contém 50 bilhões de pares de bases e o genoma do lírio contém 250 bilhões.

13.1 Enzimas celulares	imprimir

São os agentes naturais de manipulação do DNA.
Podem ser:

• Endonucleases de Restrição:
Reconhecem as seqüências de bases específicas na molécula de DNA e clivam o DNA na seqüência de reconhecimento, ou próximo desta, de maneira exata.
As endonucleases de restrição mais comumente usadas reconhecem seqüências palindrômicas (seqüências em que a leitura de ambas as fitas é a mesma na direção 5’ para 3’).

As endonucleases de restrição reconhecem e clivam sítios específicos da molécula de DNA. As setas indicam os sítios de clivagem. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

• DNA Polimerases:
São enzimas que copiam o DNA. Elas sintetizam uma nova fita simples que é complementar à fita-molde da molécula original, adicionando novos nucleotídeos à extremidade 3’ da fita em crescimento. Para sintetizar o novo DNA, a DNA polimerase necessita obrigatoriamente de uma fita-molde e um primer. Um primer (iniciador) é qualquer pedaço de DNA que pareia suas bases com a fita-molde, de maneira que a extremidade 3’ do primer esteja disponível para servir como ponto de início para o novo DNA. A primeira base do novo DNA é incorporada via uma ligação fosfodiéster à extremidade 3’ do primer.
As DNA polimerases têm sido purificadas a partir de uma grande variedade de organismos.

Atividade da DNA polimerase. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

• RNA Polimerases:
São enzimas que lêem uma seqüência de DNA e sintetizam uma seqüência de RNA complementar. As RNA polimerases precisam de uma seqüência especial de bases no DNA molde, chamada de promotor, que lhes sinalize onde começar a transcrição, mas não precisam de um iniciador (primer).
Elas são purificadas de diversos organismos.

Atividade da RNA polimerase. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

• DNA Ligases:
Combinam fragmentos de DNA (ou RNA) por meio da formação de novas ligações fosfodiéster entre os fragmentos.

Atividade da DNA ligase. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

• Transcriptases Reversas:
Lêem uma seqüência de RNA e sintetizam uma seqüência de DNA complementar, freqüentemente abreviado como cDNA. Estas enzimas são sintetizadas por vírus de RNA que convertem seu RNA para DNA quando infectam um hospedeiro.
Isto é útil quando se empregam bactérias (procariotos) para expressar um produto protéico a partir de um gene eucariótico. Assim o processo de produzir cDNA a partir de mRNA é importante.

13.2 Vetores naturais	imprimir

O termo é usado para descrever qualquer veículo que carrega o DNA para o interior de uma célula hospedeira. Plasmídeos e vírus são vetores naturais muito úteis, pois carregam o DNA para uma nova célula hospedeira e garantem a manutenção daquele DNA no interior dessa célula.
Plasmídeos que ocorrem naturalmente são utilizados para a transferência do DNA via transformação. Além de pequenos, os plasmídeos são replicados pelas células hospedeiras e distribuídos para as células filhas durante a divisão celular (o emprego de um plasmídeo é a forma mais comum de clonagem de um gene inserido no plasmídeo).
Um plasmídeo natural particularmente útil é o plasmídeo “Ti” do patógeno de plantas Agrobacteruim tumefaciens. Infelizmente, nem todas as plantas são susceptíveis à infecção por Agrobacterium tumefaciens.
Os vírus têm a vantagem de ser de extrema especificidade para o hospedeiro. Genes “estranhos” podem ser colocados em células específicas pelo vírus apropriado.

14.1 Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel	imprimir

A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria, como a gelatina.
Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel.
Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares. É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados para torná-los visíveis. Os fragmentos de DNA também são isolados e purificados a partir dos géis de agarose.

Eletroforese em gel de fragmentos de DNA. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

14.2 Hibridização	imprimir

Hibridização é o termo usado para descrever o processo em que duas fitas simples de DNA com seqüência de bases complementares mantêm-se unidas para formar uma molécula de DNA dupla fita, com as bases corretamente pareadas.

14.3 PCR: amplificação do DNA	imprimir

Na PCR são sintetizados dois oligonucleotídes iniciadores que hibridizam às fitas opostas nos limites do fragmento a ser copiado da molécula de DNA. A DNA polimerase copia então ambas as fitas, iniciando nos dois oligonucleotídeos.
Como a mistura de reação contém os oligonucleotídeos complementares às duas fitas de DNA, os próprios produtos da síntese de DNA podem ser copiados com o oligonucleotídeo oposto.
Através desta técnica é possível se obter milhões de cópias de um dado segmento de DNA.

A PCR produz muitas cópias de um segmento de DNA que se situa entre, e inclui, as seqüências em que os dois primers hibridizam na molécula substrato de DNA. Os primers normalmente são oligonucleotídeos sintéticos. Fonte: Kreuzer, H. & Massey, A. (2002)

14.4 Transferência de fragmentos de DNA: “Blotting”	imprimir

Os fragmentos do DNA são separados por eletroforese em gel de agarose e então esse gel é coberto com uma membrana e papel absorvente.
Os fragmentos no gel são transferidos para a membrana exatamente com a mesma disposição que estavam no gel.
Os fragmentos de DNA na membrana podem ser hibridizados a sondas para checar a presença de seqüências específicas.